产品货号:
JN5041
中文名称:
2×SYBR qPCR SuperMix Plus(High ROX)
英文名称:
2×BalbStart SYBR qPCR SuperMix Plus(High ROX)
产品规格:
5mL|25mL
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本制品是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。预混液中已经将DNA聚合酶、精心优化的反应Buffer、dNTPs、SYBR Green I等试剂预混在一起,是一种2×浓度的预混型试剂,进行实验时,PCR反应液的配制十分简单方便。
本制品使用新型抗体修饰的HotStart Taq DNA聚合酶,并结合精心优化的反应Buffer,从而有效抑制低温下的非特异性扩增,提高反应特异性和扩增效率,能够在更宽广的范围内进行准确定量。
- 高特异性:采用新型工艺制备抗体修饰的HotStart Taq DNA聚合酶,无需热启动即可进行PCR反应,大大提高PCR扩增的特异性。
- 高效:精心配制的RealTime PCR专用2×SuperMix,具有更高的扩增效率和扩增灵敏度。
- 快捷:PCR反应所必需试剂集于一管之中,数分钟即可完成反应体系配制。
组分 | 5mL | 25mL |
2×SYBR qPCR SuperMix Plus(High ROX) | 1mL×5 | 1mL×25 |
RNase Free Water | 1mL×5 | 1mL×23 |
保存:-20℃,避光
如需在一段时间内经常取用,可在2~8℃条件下储存3个月。避免反复多次冻融。
本制品中包含用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差的高浓度ROX Reference Dye,适用于以下仪器:
ABI 7000/7300/7700/7900/7900 HT/7900 HT Fast;ABI StepOne/StepOnePlus及其他需要添加高浓度ROX Reference Dye的荧光定量仪器。
纯度检测:所有组分经检测均无核酸内切酶残留、核酸外切酶残留、核酸残留。
- 使用:请上下颠倒轻轻混合均匀,避免起泡,并经轻微离心后使用。反应液的配制、分装请使用新的(无污染的)枪头、Microtube等,避免污染。建议反应体积为20~50μL。
- 引物设计:一般为了增加灵敏度及扩增效率且抑制非特异性反应,扩增目标序列越短越好。建议设计成200bp以下。
- 常用反应体系
成分 用量 2×SYBR qPCR SuperMix Plus(High ROX) 10μL 上游引物 0.2~1.0μM(终浓度) 下游引物 0.2~1.0μM(终浓度) 模板 1~2μL RNase-Free Water 至20μL - 常用PCR循环
两步法可获得高特异性,三步法可获得高扩增率,用户根据需要选择合适的扩增程序。- 两步法扩增程序:
温度 时间 循环数 95℃ 1分钟 1 95℃ 10秒 35~45 60℃ 30秒 - 三步法PCR扩增程序:
温度 时间 循环数 95℃ 1分钟 1 95℃ 10秒 40 50~60℃ 20秒; 72℃ 30秒
- 两步法扩增程序:
- 无Ct值出现
- 检测荧光信号的步骤有误:一般染料法采用72℃延伸时采集,探针法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
- ROX使用错误或者加量有偏差:当ROX浓度太低或太高时,都会影响机器修正后显示的荧光值,Ct值会显示为unknown或空白,可以根据仪器的类型选择合适的ROX类型(I或II),并严格按照1:50的比例添加。
- 引物或探针降解:可通过电泳检测其完整性。
- 模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
- 模板降解:避免杂质的引入及反复冻融,必要时可以重新制备模板。
- 检测荧光信号的步骤有误:一般染料法采用72℃延伸时采集,探针法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
- Ct值出现过晚(Ct>38)
- 扩增效率低,反应条件不够优化:设计更好的引物或探针;适当降低退火温度;改为三步法扩增。
- PCR各种反应成分降解或上样量不足:更换试剂或加大上样量,重复实验。
- PCR产物太长:一般采用80bp~150bp的产物长度。
- 热启动时间过短,酶活性中心没有完全暴露,活性发挥受到了影响:建议热启动时间不低于1分钟。
- 扩增效率低,反应条件不够优化:设计更好的引物或探针;适当降低退火温度;改为三步法扩增。
- 扩增曲线异常,如断裂或者锯齿状曲线?
- ROX使用错误或者加量有偏差:ROX浓度太低或太高时,机器对荧光值进行修正后会产生断裂的曲线,可根据说明书进行调整。
- 分析数据时通道选择不正确,如没有在PCR mix中加入ROX,但分析时在仪器设置中选择了ROX选项,应根据反应的具体操作情况选择合适的通道。
- 模板的浓度太高/降解或荧光染料发生了降解:建议更换模板或mix。
- 反应管内有气泡:混匀后离心,避免气泡的残留。
- 程序设置时间不当:适当延长延伸时间(40~60秒),充分收集荧光信号。
- ROX使用错误或者加量有偏差:ROX浓度太低或太高时,机器对荧光值进行修正后会产生断裂的曲线,可根据说明书进行调整。
- 标准曲线线性关系不佳
- 加样存在误差,导致标准品不呈梯度:重新加样并重复实验。
- 标准品出现降解:应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品。
- 引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针。
- 模板中存在抑制物,或模板浓度过高:更换模板或提高模板稀释倍数。
- 加样存在误差,导致标准品不呈梯度:重新加样并重复实验。
- 负对照有信号
- 引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
- 引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。
- 模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,可以稀释模板的浓度或者更换模板。
- 反应体系污染:更换mix、水或者引物等,避免交叉污染。
- 引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
- 溶解曲线不止一个主峰
- 引物浓度过高或者设计不够优化:应降低引物浓度或者重新设计引物,避免产生引物二聚体。
- 体系被污染:更换试剂后重复实验。
- 反应条件不够优化,引起非特异性扩增:设计特异性更高的引物或探针;适当提高退火温度。
- 引物浓度过高或者设计不够优化:应降低引物浓度或者重新设计引物,避免产生引物二聚体。
- 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线,如何判断?
判断标准:扩增效率,灵敏度,特异性。如果扩增效率在90%~110%,都是特异性扩增,可以把数据用于分析。 - 溶解曲线中,Tm不出现在80度左右是怎么回事?
扩增片段100bp左右的,一般应该出现在80度左右。如果低于此温度出现,可能是模板降解。 - 溶解程序可否不加?
如果扩增效果好,特异性高,可以选择不加溶解程序(建议加上)。此外,不同的机型对应不同的溶解曲线设置程序,可根据机型进行相应的设置。 - 扩增反应体系5μL,扩增效率低,是什么原因?
反应体系太小,各种因素的影响相对较大,比如引物浓度、模板浓度及金属离子等都会影响扩增效率。
相关搜索:2×SYBR qPCR SuperMix Plus(High ROX),SYBR,染料法,qPCR,荧光定量,Real-Time,嵌合荧光法,PCR预混液,PCR反应液,预混反应液,MasterMix,HotStart,热启动,Taq酶,PCR扩增,DNA扩增,2×BalbStart SYBR qPCR SuperMix Plus(High ROX)